Les Protéinuries : Analyses et Interprétations au Laboratoire

L’analyse de la protéinurie est un des examens urinaires les plus demandés au laboratoire.

La protéinurie signifie la présence de protéines dans les urines.

protéinurie physiologique: <150mg/24h chez l’adulte dont moins de 30mg/24h d’albumine et < 0,14g/m2 de surface corporelle chez l’enfant.

protéinurie pathologiques > 150mg/24h (soit intermittente ou permanente).

Peut révéler une néphropathie cliniquement muette. Une fois décelée, il est important de la caractériser de façon  quantitative et qualitative afin d’en déterminer l’étiologie.

QUELQUES DEFINITIONS

Protéinurie physiologique:

Définition quantitative: protéinurie comprise entre 50 et 150 mg/24h dont moins de 30 mg/24 h d’Albumine.

Définition qualitative: déterminée à partir d’un protéinogramme.

Les protéines urinaires comportent physiologiquement :

1/3 d’Albumine.

2/3 de globulines.

Protéinurie pathologique: on se base sur 3 critères

• Importance de la quantité éliminée: > 150 mg/24h.

• Nature des protéines présentes: albumine, chaînes légères…

• Caractère permanent, intermittent ou transitoire.

• (Microalbuminurie > 30 mg/24h : Signe  précoce de certaines néphropathies métaboliques à début insidieux: exemple du Diabète ).

PHYSIOPATHOLOGIE

Chaque jour environ 180 litres de plasma sont filtres par les néphrons (glomérule +dispositif tubulaire) au niveau du rein.

La protéinurie est la résultante au niveau du néphron de:

• Filtration glomérulaire des protéines.

• Réabsorption tubulaire proximale active suivie de leur catabolisme.

• Sécrétion tubulaire distale  (protéine de Tamm-Horsfall).

Filtration glomérulaire : FG

Phénomène passif qui consiste à une ultrafiltration plus diffusion passive = 150 -180l/j  sont ultrafiltrés par la membrane basale glomérulaire.

Facteurs conditionnant la FG :

• Taille : le glomérule est imperméable aux molécules dont le PM>67 KD (protéines, macromolécules perméable à la molécule dont le PM< 20 KD (eau, électrolytes.)

• Charge :augmentation de la filtration si la charge est positive de la molécule® cations > neutres> anions.

• Configuration spatiale : molécules sphérique et sous forme d’ellipse sont mieux filtrés

• Paramètres hémodynamiques : flux sanguin et pression de filtration

• Intégrité glomérulaire

• Concentration plasmatique

 Réabsorption tubulaire

Phénomène actif, saturable ; 99% des protéines ultrafiltrés vont être réabsorbés au niveau du Tube Contourné Proximal.

La capacité de réabsorption tubulaire d’une protéine est limitée par son seuil de réabsorption maximale au-delà duquel la protéine apparaît dans les urines.

• L’urine définitive résultant d’un double mécanisme d’ultrafiltration glomérulaire et de réabsorption tubulaire ne contient finalement qu’une quantité infime de protéine (<100 mg/l) : Environ 1/3 d’albumine et de 2/3 de protéines.
• Les protéinuries pathologiques résultent de différents mécanismes
  • Altération glomérulaire et/ou tubulaire
  • Saturation de la capacité de réabsorption à augmentation du taux de protéines
  • Problèmes hémodynamique
• Sécrétion tubulaire
• Au niveau de l’anse de Henlé ; sécrétion de : Protéine Tamm Horsfall, Orosomucoïde, urokinase, IgA sécrétoire).

METHODES D’ETUDE D’UNE PROTEINURIE

Circonstances de découverte:

• Découverte fortuite suite à un dépistage systématique 

• Tableau évoquant une atteinte rénale : œdème ; HTA, douleurs lombaires

• Protéinurie de Bence-Jones : sujet âgé, douleurs osseuses, taux de protides élevés…

• Surveillance de la grossesse

• Bilan d’un diabète; HTA; maladie générale

Etape pré analytiques :

Préparation du patient

Un exercice musculaire, l’orthostatisme prolongé, ou la fièvre peuvent entraîner une protéinurie. 

perfusion par un soluté de remplissage à base de gélatine, perfusion d’immunoglobulines humaines (problème d’interférence) 

Importance des renseignements cliniques fournis par le  prescripteur.

toilette vaginale chez la femme avant le recueil des urines. 

Recueil des urines

Dans un récipient propre. il y a 3 Types de recueil des urines:

Urines de 24h :

Constituent actuellement le prélèvement le plus adapté à  l’exploration précise d’une protéinurie (l’élimination rénale des protéines  est inconstante au cours du nycthémère)

le dosage de la créatininurie effectué en parallèle à celui de la protéinurie est un indicateur fiable de la bonne qualité du recueil.

(VN: 8-12 mmol/24 h chez la femme et entre 10 à 16 mmol/24 h chez l’homme).

Urines de miction :

Lorsque le recueil sur 24h est difficile : l’exploration d’une protéinurie est possible sur un échantillon d’urine.

En cas de protéinurie pathologique: contrôler sur des urines de 24h.

Exprimer le résultat en ratio protéinurie/ créatininurie

Recueil fractionné :

Différencier une protéinurie permanente d’une protéinurie intermittente.

Protéinurie orthostatique par exemple : urine de matin recueillie dés le Lever puis urine de la matinée (entre 7h et 9h) après une station debout prolongée pour la mettre en évidence  d’une protéinurie orthostatique.

La protéinurie doit disparaître en clinostatisme.

Miction matinale : Dépistage de masse

Quel que soit le type de recueil, il sera important de noter la présence éventuelle :

Pus dans les urines

Leucorrhée chez la femme

Hématurie (hémoglobine => majoration importante du dosage des protéines => bande supplémentaire sur les supports électrophorétiques).

Perfusion de soluté de remplissage (Plasminon®; Gelofusine®) ou d’Ig intraveineuse   => Problème d’interférence, images inhabituelles du protéinogramme urinaire.

L’exploration des protéines urinaires doit être faite sur des urines
fraichement émises (dosage dans le 2h).

Une centrifugation de 10 min à 3000 trs/min doit précéder toute analyse qualitative des proteines urinaires pour éliminer les cristaux, éléments figurés et les bactéries.

Conservation

La majorité des protéines  urinaires ont une bonne stabilité durant une semaine à +4 °C.

La congélation à -20 °C diminue la concentration des IgG.

Les congélations-décongélations répétées ne sont pas recommandées (dénaturation de certaines protéines).

Urine 24h: il est préférable d’ajouter dans le récipient un antiseptique (merthiolate ou azoture de Na à la concentration de 0,1 %)  afin d’éviter toute prolifération bactérienne.

Certains conservateurs doivent être évités comme l’acide borique qui  détruit les protéines, ou le thymol qui interfère avec certaines techniques de dosage (bleu de Coomassie et acide sulfosalicylique).

Techniques d’exploration biologique des protéinuries

Dépistage

Dosage quantitatif

Analyse qualitative

Techniques de dépistage :

Reposent sur 3 principes :

Réaction protéines/colorant (bandelettes réactives).

La précipitation par les acides

La coagulation par la chaleur.

Bandelettes réactives : Imprégnées par tampon citraté (pH=3) +colorant (bleu de tétrabromophénol)

Vire du jaune au bleu en passant par le vert.

principe repose sur la liaison des protéines chargées négativement  avec le colorant dont la coloration varie en fonction du pH.

Des réactifs prêts à l’emploi sont commercialisés : Labstix®, Multistix® (Bayer); Combstix® (Roche).

Technique simple et rapide ; Peu sensible (0,15 à 0,2 g/l) ; Semi quantitative

Le résultat visuel ou automatisé va de zéro à quatre croix.

Avantages:

• Simple et peu onéreux
  • Praticable en dehors du labo
  • Apporte des informations supplémentaires : PH; corps cétoniques; GR, glucose……

Limites :

• L’appréciation du virage de la bandelette est assez subjective. 

Faux positifs :

• Urine alcaline (vérifier le pH).
  •  Lecture différée (> 1min).
  •  Interférences des métabolites.
  • Présence de sang, pus, ammonium quaternaires dans les urines.

Faux négatifs :

• Conditions de conservations non respectées.
  • Protéinurie de Bence Jones.
  • Une protéinurie < 150-200 mg/L, n’est habituellement pas détectée par les bandelettes réactives.
• Tests d’agglutination
  • à l’aide d’anticorps anti-albumine  humaine (Three-drop® et « Albutest® ).
  • Ils permettent de détecter les concentrations d’albumine de l’ordre de 25 à 170 mg/L.
• Acide nitrique :
  • Les protéines dénaturées par l’acide nitrique concentré précipitent au contact de cet acide. 
  • Dans un tube à essai, introduire 2 ml d’acide nitrique concentré, puis avec beaucoup de précaution et sans mélanger, ajouter 2 ml d’urine  limpide le long de la paroi du tube.
  • Laisser reposer 5 à 10 minutes puis observer.
  • En présence de protéines => apparition d’un disque blanc mince et net à la surface de séparation de l’acide et de  l’urine  dont l’épaisseur et le temps d’apparition est fonction de l’importance de la protéinurie.
• Méthodes de thermo-coagulation (bence-jones) :
  • La protéine de Bence-Jones est caractérisée par sa thermo-solubilité, c’est-à-dire par le fait qu’elle précipite à 50-60°C, se redissout à 90-100°C et reprécipite en refroidissant.

Dosage quantitatif 

• Techniques turbidimétriques (Techniques par précipitation).
  • Est la mesure de l’intensité de la lumière transmise par le milieu. Elle est   mesurée dans l’axe du rayon incident.
  • La lumière a été perdue par absorption, réflexion et surtout diffusion.
  • Valable pour un taux de protéine de 0,05 à 1,5 g/l, si concentration élevé faire des dilutions.
  • Elles utilisent comme agent précipitant: 
• acide sulfosalicylique en milieu acide.
• acide trichloracétique en milieu acide.
• chlorure de benzéthonium en milieu alcalin.
  • Les protéines doivent précipiter sous formes d’une suspension homogène de fine particule, pour cela augmenter la viscosité du milieu par addition des polymères, diminuer l’effet de la gravité par agitation.
  • La sensibilité est plus élevée pour l’acide sulfosalicylique et le chlorure de benzéthonium que pour l’acide trichloracétique.
  • Seuil de détection acide sulfosalicylique et trichloracétique: 0.05 g/l
  • Domaine de mesure: 0,1 à 2 g/L.
  • Reproductibilité : CV < 8%  (Acide sulfosalicylique)
  • CV inter-laboratoire (1998) : 35%
  • Faire des dilutions : si suspension non homogène

Limites

• Les urines fortement alcalines => faux négatifs.

Interférences : produits de contraste, pénicilline, antifongiques, aspirine.

• agents précipitant (surtout l’acide sulfosalicylique) sous-estiment les gammaglobulines par rapport à l’albumine.
• Cet effet est dépendant de la température pour l’acide trichloracétique (reconnaît de manière identique l’albumine et les gammaglobulines entre 20-25 °).
• Certaines protéines sont mal précipitées par les acides, ce qui ne permet pas de prendre en compte les protéinuries tubulaires : protéine de Tamm- Horsfall, certaines microprotéines et les glycoprotéines acido-solubles (orosomucoïde).

Avantages : peu coûteuses, simples et sensibles.

• Ces méthodes sont peu employées du fait des difficultés de maîtrise des conditions opératoires
• Techniques colorimétriques :
  • Les techniques colorimétriques fondées sur la fixation de colorants sur les protéines sont les plus utilisées.
  • Trois colorants les plus utilisés :
• Le rouge de pyrogallol (méthode de Fujita, 1983),
• Le bleu de Coomassie G250 (méthode de Bradford, 1976), 
• Le violet de pyrocatéchol.
  • Leur comportement réactionnel est relativement similaire.

Avantages analytiques :

• Absence d’interférences médicamenteuses connues
• Une automatisation aisée en grande série
• bonne sensibilité, bonne praticabilité, bonne répétabilité.
•  reproductibilité acceptable.

Bleu de Coomassie

• Colorant majoritairement utilisé jusqu’en 1990  et malgré des améliorations sur la  composition des réactifs (ajout de SDS),  son utilisation est aujourd’hui marginale.
• Le complexe protéines-bleu de Coomassie absorbant à 595 nm, possède un fort coefficient d’extinction en faisant une technique très sensible (2,5 mg/L). 
• Les principaux problèmes qui ont conduit à son abandon sont liés à sa mauvaise praticabilité :
  • Réactif corrosif.
  • Adsorption sur les tubulures, les cuvettes réactionnelles et de mesure.
  • Colorant mal défini avec des variations interlots.
  • Domaine de mesure limité à 1 g/L.
  • Il réagit avec l’hémoglobine.
• Avantage:
  • Grande sensibilité,
  • Reconnaît très mal les fragments de gélatine éliminés dans les urines  après perfusion de solutés de remplissage évitant ainsi des faux positifs

Rouge de pyrogallol

•  Ce colorant a progressivement remplacé le bleu de Coomassie.
• En milieu acide (pH 2,5), le colorant combiné avec le molybdate absorbe à 460 nm et se déplace à 598 nm après association avec les groupements amines des acides aminés des protéines.
• De l’oxalate est ajouté afin d’éliminer les valeurs négatives dues à la présence de substances chélatrices du molybdate.
• La liaison du colorant s’effectue essentiellement avec les groupements amines des acides aminés basiques, peu avec celui des acides aminés acides. 
• La sensibilité est  inférieure à celle du bleu de Coomassie,  mais reste  suffisante (Domaine de mesure 0,05 à 4 g/L).
•  Le rouge de pyrogallol interfère avec la  gélatine (~ 15 %) ce qui en fait  une interférence positive fréquente et parfois massive chez les patients de réanimation.
• Le rouge de pyrogallol réagit  avec l’hémoglobine.
• Il n’existe à l’heure actuelle aucune interférence médicamenteuse décrite  avec le rouge de pyrogallol.

Violet de pyrocatéchol

• Depuis 1998, il existe un dosage des protéines urinaires utilisant la technologie de la chimie sèche (Upro®, Vitros), le colorant étant le violet de pyrocatéchol.
• Le principe de la méthode repose sur le déplacement du spectre  d’absorption de 450 à 670 nm lorsque les protéines se fixent sur un complexe molybdate-pyrocatéchol en présence d’oxalate.
• Le CV interlaboratoire est le meilleur de toutes les techniques des protéines  urinaires (5,5 %).
• Cette technique ne reconnaît pas les solutés de remplissage vasculaire à  base de gélatine.
•  Il n’existe aucune interférence médicamenteuse décrite avec le violet de  pyrocatéchol.
• Dosage des protéines spécifiques: Par techniques immunologiques
  • En milieu solide : immunodiffusion radiale
  • En milieu liquide:
• immuno-turbidimétrie (sensibilité 5mg/l)
• immuno-néphélémétrie (sensibilité ~ 2mg/l)
  • Radio immunologie
  • immunoenzymologie
  • Intérêt dans le dosage de la microalbuminurie.

• Expression des résultats :
  • Selon le type de recueil utilisé et les habitudes du laboratoire, les résultats du dosage de la protéinurie totale ou ceux des protéines spécifiques seront exprimés:
• En résultat pondéral : g/l ou mg/l si les dosages sont effectués sur un échantillon d’urine de miction.
• En débit protéique par unité de temps : g/24h ou mg/mn s’il s’agit d’un échantillon des urines de 24h.
•  En g/mmol ou en g/g de créatininurie si celle-ci est connue.

Etude qualitative d’une protéinurie

Le fractionnement des protéines urinaires permet d’obtenir des renseignements précieux sur la localisation d’une atteinte rénale.

Deux types de méthodologies par ailleurs complémentaires:

• Les techniques électrophorétiques séparant les protéines selon leur poids moléculaire ou leur charge électrique sur des supports de nature différentes.
  • techniques d’immunoprécipitation en milieu gélifié combinant une électrophorèse a une révélation faisant appel à des réactifs immunochimiques spécifiques des protéines à caractériser (la plus utilisée : immunofixation).

Seuil de détection d’environ 15mg/l.

• Electrophorèse séparant les protéines  selon leur PM :
  • Permet en une seule étape, la séparation des protéines  de faible PM (>67 kDa), d’origine essentiellement tubulaire, et des protéines de haut PM (>67kDa) essentiellement d’origine glomérulaire.
  • Permet de classer facilement la protéinurie de type glomérulaire, tubulaire, ou mixte.
  • Toute bande de mobilité d’environ 25 kDa laissera supposer la présence de chaines légéres libres (polyclonale ou monoclonale) => à identifier à l’aide d’un kit spécifique des prot de Bence Jones. 
  • La nature d’une bande anormale pourra être identifiée selon son poids moléculaire en comparaison à une gamme de PM connue. 
• Electrophorèse séparant les protéines selon la charge électrique:
  • Elle permet de détecter les bandes monoclonales dans la mesure où elles sont situées dans la zone gamma ou dans les interzones.
  • Toute bande monoclonale devra être identifiée soit à une Ig complète, soit à une chaine légère libre, à l’aide d’un kit spécifique de l’identification des protéines de Bence Jones.
  • De faibles bandes monoclonales peuvent être supposées à des protéines des zones α1, α2 ou β.
  • La caractérisation de la protéinurie est difficile dans la mesure où des protéines  d’origine tubulaire ont des mobilités similaires aux prot d’origine glomérulaires.
  • Exemple: *α1microglobuline migre au même niveau que l’orosomucoïde.

   *le retinol binding protein (RBP) migre en α2.

Cas particuliers

• Selon le PM :

Des bandes qui ont une mobilité dans la zone des hauts PM, en présence d’une faible quantité d’albumine et absence de transferrine laisseront suspecter la présence de chaines légères polymérisées=> renouveler le test après traitement réducteur au bêta mercapto-éthanol.

De même une seule bande forte au nv de l’albumine, sans transferrine ni trace d’Ig laissera suspecter une chaine légère polymérisée.

•  Selon le PM ou le point isoélectrique:

La présence d’une perfusion de soluté de remplissage type Plasminon® donne une trainée colorée sur tout le profil, pouvant masquer des bandes.

L’injection d’IgG intraveineuse pourra donner des fragments d’Ig dégradés.

Dans ces deux cas un 2eme prélèvement d’urine doit être analysé 48 h après la perfusion. 

• Immunofixation
  • Méthode immunochimique combinant une séparation électrophorétique et l’utilisation d’antisérums spécifiques des protéines à caractériser.
  • Remplace la thermocoagulation à la recherche de la protéinurie de BJ.
  • 3 étapes:
• Électrophorèse à pH alcalin sur gel d’agarose.
• Fixation et immunoprécipitation des protéines séparées.
• Coloration des fractions précipitées après incubation et lavage.
  • Immuns sérums spécifiques utilisés sont : antisérum anti IgG, IgM, IgA; anti Κ et λ libres et liées; anti Κ  libres et  anti λ libres. (Selon la nature des antisérums utilisés elle permet aussi le typage de la protéinurie (antisérums dirigés contre les protéines glomérulaires ou tubulaires).

Notion de sélectivité de la protéinurie glomérulaire  2 types de protéinuries (électrophorèse des protéines urinaires): Protéinurie sélective:  Protéinurie constituée essentiellement d’albumine (>85% d’albumine ou clairance IgG/clairance transferrine < 0,1).  Elle correspond à une perte des charges anioniques de la membrane basale glomérulaire sans lésions observées au  microscope optique. Protéinurie non sélective:  Protéinurie constituée d’albumine et de protéines de haut poids moléculaire (immunoglobulines).  Elle correspond à des lésions observées au microscope optique.   Deux types d’index pour apprécier la sélectivité d’une protéinurie glomérulaire :    Index de Cameron : Clairance Transferrine/Clairance IgG.     Index de Créteil plus récent : Clairance Albumine/ Clairance IgG.

Examens complémentaires :

• Fonction rénale : urée créatinine
• Ionogramme
• Protidémie et électrophorèse des protides sériques
• Glycémie
• Lipides plasmatiques
• NFS
• Examens morphologiques : échographie, TDM, IRM, UIV
• Ponction biopsie rénale

CLASSIFICATION DES PROTEINURIES

1. Protéinuries intermittentes :

Constituent un trouble purement fonctionnel de nature essentiellement bénigne.

En général quantitativement modérées,  ne sont pas le témoin d’une néphropathie organique.

Ce sont :

• Les protéinuries orthostatiques de l’adolescent longiligne en période de croissance (cause la plus fréquemment rencontrée)
• Les protéinuries digestives post prandiale
• Les protéinuries d’effort survenant physiologiquement après un sport violent.
• Les protéinuries survenant après un stress émotionnel ou une exposition au froid.

2. Protéinuries permanentes

Contrairement aux protéinuries fonctionnelles, ces protéinuries traduisent toujours une souffrance rénale au niveau du néphron. 

3. Protéinuries Rénales

Protéinuries glomérulaires

1. Les plus fréquentes chez l’enfant et l’adulte.
2. Quantitativement importante (>1g/24h).
3. Albuminurie prédominante (>70%).
4. Comportent des protéines de PM élevé (>67 kDa).
5. Accessoirement : transferrine, α1antitrypsine, α2 glycoprotéine acide
6. Elles sont dites sélectives ou non sélectives selon la présence ou non  d’IgG. 
7. Elle peut être abondante, entraînant un syndrome néphrotique quand elle est supérieure à 3 g/24 heures, associée à une albuminémie  inférieure à 30 g/L, et une protéinémie < 60 g/L.
8. Peut être associée à une hématurie macroscopique.

Protéinuries tubulaires

• Plus rare
• Quantitativement modérées, le plus souvent <1g/24h.
• Majoritairement constituée de microprotéines non réabsorbées (<40kDa).
• Albuminurie est minoritaire (<30%).
• Microglobulines α1 et α2, les hormones peptidiques, les chaines légères   d’immunoglobulines, protéine de liaison du rétinol. béta2-microglobuline, rétinol binding protein.

Protéinurie mixte : glomérulaire et tubulaire

• Quantitativement importante (>1g/24h)
• Majoritairement constituées d’albumine, ms aussi de microprotéines.
•  très svt associées à une insuffisance rénale.
• Liée soit :
  •  Atteinte diffuse du parenchyme rénal
  •  Nécrose tubulaire à la suite d’une glomérulonéphrite chronique

Protéinuries pré-Rénales ou de surcharge

• Protéines plasmatiques produites et filtrés en grandes quantités.
•  Déborde la capacité de réabsorption des tubes.
•  hyperproduction de glycoproteines de l’inflammation (orosomucoide par exemple) dans certains cancers.
•  hyperproduction de chaines légères libres monoclonales (Protéinurie de  Bence Jones) dans les gammapathies monoclonales (myélome +++).
•  libération après lyse cellulaires : d’hémoglobine dans les hémolyses intravasculaires, de myoglobine dans les myolyses ou de lysozyme dans les leucémies myéloïdes à composante monocytaire. 

Protéinuries post rénales :

• Sans atteinte rénale
• Origine: atteinte vésicale, urétérale ou uréthrale
• Hémorragie du tractus urogénital
• Infection
• Exsudation: lésions inflammatoires ou dégénératives de l’uretère, vessie, prostate.
• Recherche de a2macroglobuline (PM+++)

CONCLUSION

• Protéinurie : signe souvent révélateur d’une néphropathie.
• Elle peut témoigner d’affections graves notamment glomérulaires évoluant vers l’insuffisance rénale chronique.
• L’exploration d’une protéinurie au laboratoire s’effectue selon des examens hiérarchisés : dépistage, dosage de la protéinurie totale, puis techniques d’analyse qualitative.
• Toute protéinurie quantitativement anormale (>150mg/24h) doit être suivie d’une identification et d’une quantification des protéines qui la composent.